DNA as the genetic material

Structure of DNA

關於基本的 DNA 介紹可以到 Macromolecules 章節觀看。

Discovery of DNA

DNA 在現今已經得到大眾的認知，但就在一世紀前左右，一些最頂尖的科學家並不知道 DNA 是 hereditary material

Protein vs. DNA

Mendel 找到遺傳現象，而 Boveri, Sutton, Morgan 發現遺傳因子出現在 chromosomes

  • 但 chromosome 上有大量 protein 和 DNA

    • 到底是誰決定了遺傳因素

    • 這時候各大科學家都覺得是 protein

      • 因為 protein 有多樣的 amino acid sequences

      • 而 DNA 只是無趣且不斷重複的 polymer

        • 當然還沒發現 DNA 架構

於是就開始有一連串的研究，最終發現 DNA 才是真正的遺傳因子

  • Frederick Griffith

  • Avery, McCarty, and MacLeod

  • Hershey and Chase

Frederick Griffith: Bacterial transformation

  • 1928 年，英國的細菌學家 Frederick Griffith 進行了一個實驗

    • 想要找出能夠對抗肺炎的疫苗

    • 他將兩種 Streptococcus pneumoniae bacteria 注射到老鼠身體中

      • R strain

        • 是 nonvirulent 的 (老鼠注射後不會死亡)

      • S strain

        • 是 virulent 的 (老鼠注射後會死亡)

  • 他將 S strain 的細菌利用高溫殺死，變成 heat-killed S strain

    • Heat-killed S strain 沒有將老鼠致死

    • 但 heat-killed S strain 和 R strain 加在一起卻將老鼠致死 !!

R strain 可能是從 heat-killed S strain 獲得了什麼

  • Griffith 認為 R 從 heat-killed S 取得 transforming principle

    • 讓 R 變成能夠致死的 bacteria

  • 事實上，這是因為 S strain 雖然死亡，但裡面的 DNA 沒有死亡

  • DNA 混入 R strain 讓他變得能夠致命

Avery, McCarty, and MacLeod: Identifying the transforming principle

  • 1944 年，加拿大和美國的三個科學家 Avery, McCarty, MacLeod

    • 想要找出 Griffith 實驗中的 transforming principle

    • 他們培養了大量 heat-killed S cells 然後進行實驗

    • 將 transforming principle 盡可能的淨化，然後進行分析

有幾個證據都指出 transforming principle 就是 DNA

  • 在 detect protein 的測試中是 negative，但在 DNA 測試中是 positive

  • 淨化的物質成分和 DNA 的 nitrogen 與 phosphorous 的比例很接近

  • Protein 和 DNA degrading enzymes 都對 transforming principle 有些微效果

    • 但可以完全消除 transforming activity 中的 DNA

這時候的三人，都還不敢完全確定 transforming principle = DNA，直到 1952 年 ...

The Hershey-Chase experiments

  • 1952 年，美國科學家 Hershey 和 Chase

    • 研究 bacteriophage (病毒如何攻擊細菌)

    • Phages 是由 protein 外層包覆 DNA 內層的病毒

      • Phages 會依附細菌細胞的外部，然後注入一些物質到細菌的細胞中

      • 該"物質"會給細菌細胞一連串的指令，生產更多的 phages

      • 這個"物質"就是 phage 的 genetic material

在實驗開始前，兩人本來是想要證明這個 genetic material 就是 protein

  • 實驗中，他們準備了兩群 phages，讓 phages 出生在特定的輻射環境

    • 一群生產於 35S^{35}S (radioactive isotope of sulfur)

      • 該 sulfur 只會出現在 protein 中

      • 所以輻射會標註 phage proteins 的部分

    • 一群生產於 32P^{32}P (radioactive isotope of phosphorous)

      • 該 phosphorous 只會出現在 DNA 中

      • 所以輻射會標註於 phage DNA 的部分

細菌感染後，會被 blender 旋轉，將 phage 和細菌細胞分離

  • 較重的物質會出現在試管的底部

    • 例如細菌等物質

    • 這些物質稱為 pellet

  • 較輕的物質會浮在試管的上方

    • 例如繁殖所需使用的液體，以及 phage 跟 phage 碎片

    • 這些液體層稱為 supernatant

  • Hershey 和 Chase 接著檢驗試管中 32P^{32}P 和 35S^{35}S 的濃度

    • 發現 32P^{32}P 都出現在 pellet

    • 而 35S^{35}S 都出現在 supernatant

    • 這代表是 DNA 而非 protein 注入到細菌細胞當中 !!

至此，人類都肯定 genetic material 就是 DNA ! 但怎麼會是 DNA ?

Discovery of the structure of DNA

過了幾年後，DNA 的全貌才被幾名科學家披露 (James Watson, Francis Crick, Rosalind Franklin, and other researchers)

Chargaff's rules

澳洲的生物學家 Erwin Chargaff 分析各種生物的 DNA 找到一些重要發現

  • A, T, C, G 並不是等量

  • 這些 bases 在不同生物出現的數量不同 (但在相同生物大致相同)

  • A 的數量永遠等於 T，而 C 的數量永遠等於 G

這些發現稱為 Chargaff's rules，對 Waston 和 Crick 在日後定義 DNA 模型非常重要

Watson, Crick, and Rosalind Franklin

在 1950 年代早期，美國生物學家 James Waston 和英國物理學家 Francis Crick 一起提出 DNA 雙螺旋的 model

  • 他們研究中借鑑了 Rosalind Franklin 的發現

    • Franklin 使用 X-ray crystallography 照出了一些 DNA 架構的跡象

    • DNA 在 X-rays 照射下，一些 rays 被 crystral 中的 atoms 反射，因而出現 diffraction pattern

  • Waston 和 Crick 一看到圖片，就聯想出 DNA 是雙螺旋架構

    • 於是結合了 Franklin, Wilkins, Chargaff 等人的研究結果

    • 發表了 DNA 的 3D 架構

    • 在 1962 年，Watson, Crick 和 Wilkins 獲得了諾貝爾獎 (Franklin 過世無法得獎)

Watson and Crick's model of DNA

  • Waston 和 Crick 的 3D model 呈現出 DNA 的樣貌

    • double-stranded helix

      • 由 sugar-phosphate backbones 所組成

      • 下圖紅色和橘色部分

    • nitrogenous bases

      • 由 hydrogen bond 所組成的 pairs

      • 下圖藍色部分

  • antiparallel

    • Two-strand 是往相反方向而平行

  • right-handed

    • 兩條 DNA 互相纏繞彼此，並且多以右迴旋纏繞

Base pairs 之間會有 gap，稱為 groove

  • 若 gap 較大，稱為 major groove

  • 若 gap 較小，稱為 minor groove

  • 這些 groove 對 protein 維護 DNA 和 gene activity 非常重要

另外這些 base pairs 都是 complementary base pairs (以 A-T 和 C-G 配對)

  • 這是因為 purine (A, G) 的 hydrogen bond 地點

  • 永遠都會剛好和 pyrimidine (T, C) 的 hydrogen bond 地點對應

  • 這也解釋了 Chargaff's rule 中，為何 A 和 T 且 G 和 C 的數量永遠一致

DNA replication

Molecular mechanism of DNA replication

DNA 複製必須精準無誤，而生物之間的複製方法大致都一樣 (由 proteins 和 enzymes 主導)，以下將用大腸桿菌舉例

  • DNA replication 是 semiconservative

    • 每條 DNA 都將是新的 DNA 的樣本 (template)

    • 新的 DNA 會透過樣本，產出對應的 complementary strand

      • 也就是一個 DNA molecule 會變成 2 個 DNA molecules

      • 一個是舊的一個是新的

  • 上圖就是整個 DNA replication 的重點

    • 但有趣的是 DNA replication 是怎麼在細胞中進行的

    • DNA replication 必須又快又無錯誤 (錯誤會產生癌症)

    • 所以 DNA replication 通常會有多種 enzymes 和 proteins 來幫忙

DNA polymerase

  • DNA polymerase 是幫助 DNA replication 一個很重要的 enzyme

    • 加入新的 nucleotides 到新的 DNA chain 中，幫助合成新的 DNA

    • 必須要與 template 互補

DNA polymerases 有幾個重要特性 :

  1. 永遠需要一個 template

  2. 只能將 nucleotides 加入到 DNA strand 的 3' end

  3. 不能從 DNA chain 開始做起

    • 必須要有已經存在的 DNA chain

    • 或是有 primer 存在 (一小節的 nucleotides)

  4. 會 proofread (check their work)

    • 移除掉錯誤的 nucleotides

另外，要加入 nucleotides 需要 energy

  • Energy 從 nucleotides 身上而來

    • 因為 nucleotide 含有 3 個 phosphates

      • 跟 ATP 很像吧

    • 當 phosphate 的 bond 分解，就會釋放 energy

在大腸桿菌上，有 2 個主要的 DNA polymerases

  • DNA pol III (major DNA maker)

  • DNA pol I (support)

Starting DNA replication

DNA polymerases 和其他 replication factors 是怎麼知道從哪裡開始複製的 ?

  • Replication 會在 DNA 特定的位置開始進行

    • 這個位置叫做 origins of replication

    • 例如大腸桿菌的 chromosome 會有一個 origin of replication

      • Origin 有 245 個 base pairs，多數是 A/T base pairs

        • 因為 hydrogen bond 比 G/C 少一個，更好讓 DNA strands 分開

特殊的 proteins 會找到 origin 並與之結合，打開 DNA

  • 隨著 DNA 被打開

    • 2 個 replication forks (Y-shaped) 會出現

    • 這 2 個 forks 會往反方向移動，形成 replication bubble

  • Helicase 是第一個出現在 origin 的 replication enzyme

    • 他會透過將 DNA 拆開，幫助 forks 移動

      • 分解 nitrogenous base pairs 的 hydrogen bonds

  • Single-strand binding proteins 則是 replication protein

    • 覆蓋在 fork 周圍的舊 DNA 兩個分開的 strands 上

    • 防止 strands 回復成雙螺旋的樣子

Primers and primase

DNA polymerases 只能將 nucleotides 加到 DNA strand 的 3' end

因為 3' 才有 -OH group 作為 hook 讓 nucleotide 可以與之發生 polymerization reaction

  • 但 DNA polymerase 並不可以將 nucleotide 加到全新的 fork

    • 需要 primase (enzyme) 來幫助

    • Primase 會製作 RNA primer (primes DNA synthesis 得名)

  • Primers 會製作一小節的 nucleotides 來和 template 互補

    • 長度約為 10 個 nucleotides 長

    • 讓 DNA polymerase 可以從 primers 的尾端 3' 開始工作

也就是 RNA primer 起手，而 DNA polymerase 擴展

Leading and lagging strands

大腸桿菌的 DNA polymerase III 會有兩個 molecules 跑到 fork 上，幫助 DNA strands 複製

  • DNA polymerases 只能在 5' 到 3' 方向上製造 DNA

    • 所以隨著 template 3' 到 5' 的 fork 會變為 5' 到 3' 方向進行

      • 該 DNA strand 稱為 leading strand

      • 能夠輕鬆、連續生產 DNA 形成 strand

    • 而反向隨著 template 5' 到 3' 的 fork 會變成 3' 到 5' 進行

      • 該 DNA strand 稱為 lagging strand

      • 隨著 fork 前進，DNA polymerase 必須要脫落並重新接上 DNA 繼續製作

      • 所以 Strands 必須要分成一個個 Okazaki fragments (日本學者發現而得名) 來製作

      • 每個 fragments 都需要一個新的 primer 來幫忙開始

The maintenance and cleanup crew

除了最重要的 polymerase 和 primase 及 helicase，還有非常多 enzyme 和 proteins 幫助 DNA replication

  • Sliding clamp (protein)

    • 幫助 polymerase III 在 lagging strand 運作時，不被破壞

    • 能夠很好的到下一個 Okazaki fragment 繼續工作

  • Topoisomerase (enzyme)

    • 避免 fork 前面的 DNA 雙螺旋過度結合在一起

    • 會在 helix 弄出一個暫時的小缺口來釋放壓力

    • 之後再將缺口回復，來避免永久傷害

  • DNA polymerase I

    • 為了讓 DNA 複製的完美乾淨

    • 所以會將 RNA primers 用複製的 DNA 再一次取代掉

  • DNA ligase (enzyme)

    • Primers 留下的一些缺口會由 ligase 來幫忙補上

Summary of DNA replication in E. coli

  • Helicase 在 replication fork 處打開 DNA

  • Single-strand binding proteins 避免 fork 周圍的 DNA strands 重新結合

  • Topoisomerase 避免 fork 前方的 DNA 過度結合

  • Primase 製造對應 template 的 RNA primers

  • DNA polymerase III 擴充 primers，在 3' 後面加入新的 DNA

  • DNA polymerase I 用 DNA 將 RNA primers 取代掉

  • DNA ligase 修復 DNA fragments 的缺口

雖然大腸桿菌的 DNA replication 和其他生物、細菌都差不多，但還是有些微差異:

  • 人類有 100000 個 origins of replication

  • 人類有 5 個 DNA polymerase 來製造 DNA

DNA proofreading and repair

  • Cells have a variety of mechanisms to prevent mutations

  • During DNA synthesis, most DNA polymerases "check their work,

    • fixing the majority of mispaired bases in a process called proofreading.

  • after DNA synthesis

    • remaining mispaired bases can be detected and replaced

    • mismatch repair.

  • DNA gets damaged can be repaired by various mechanisms,

    • chemical reversal, excision repair, and double-stranded break repair.

我們都知道 gene mutation 讓細胞無限分裂複製就會造成 cancer。

其實 DNA 複製錯誤或受到傷害在身體是不斷在發生的，但身體中有一些修復機制可以預防

  • Proofreading 修正 DNA replication 的錯誤

  • Mismatch repair 修正 DNA replication 錯誤的配對

  • DNA damage repair pathways 偵測 cell cycle 任何傷害

Proofreading

DNA polymerases 不只能製造 DNA，還能檢查工作有沒有失誤

  • 檢查的過程叫做 proofreading

    • 在加入 nucleotide 時，會順便檢查是否 pair 正確

    • 若檢測到錯誤，會馬上移除並替換掉該 nucleotide

    • 結束後才繼續進行 DNA 合成

Mismatch repair

Proofreading 有時可能會有漏網之魚，所以在 DNA 複製完會進行一個 mismatch repair

  • Mismatch repair 的工作就是移除那些 mis-paired bases

    • 首先 protein complex 找出 mispaired base

    • 找到後會切掉該 base pair 包含周邊的 DNA

    • 接著 DNA polymerase 將正確的 nucleotides 補貼回去

    • 最後 DNA ligase 將切口封好

令人好奇的是 protein 如何認出 mismatch pair 中，哪一方才是新加上去錯誤的 base

  • 在細菌中，新生的 DNA 會有一個特徵稱為 methylation state

    • 舊的 DNA strand 會有 methyl (−CH3-\text{CH}_3) groups 依附在 base 上

    • 新的 DNA strand 則不會有任何 methyl group

  • 在 eukaryotes 中

    • 只有新的 DNA strand 會有 recognition of nicks (breaks)

DNA damage repair mechanisms

DNA 不只在 replication 會出現問題，整個 cell cycle 都有可能發生錯誤

  • 幸好細胞有許多機制可以偵測和修復 DNA damage

    • Direct reversal

      • 細胞的 enzyme 能夠將讓 DNA 受到傷害的 chemical reactions "undone"

    • Excision repair

      • 跟 mismatch repair 很像，修剪掉錯誤的 DNA 然後補回正確的，又分成兩種

      • Base excision repair

        • 只修復單個 nucleotide (damaged base)

      • Nucleotide excision repair

        • 修復錯誤周邊整塊 nucleotides

    • Double-stranded break repair

      • 修復 DNA 的 double-stranded 分成兩半，有兩個主要修法

        • non-homologous end joining

        • homologous recombination

Reversal of damage

  • 有很多 DNA damage 只是一些額外 atoms 透過 chemical reaction 附在 DNA 上

    • 例如 guanine (G) 可能和 methyl group 在 oxygen 部分結合

    • Methyl-bearing guanine 比起跟 cytosine (C) 配對，更想跟 thymine (T) 配對

    • 要解決問題，一些 enzyme 只要移除掉 methyl group (reverse reaction) 就行

Base excision repair

  • Glycosylases (group of enzymes) 在 base excision repair 扮演重要角色

    • 每個 glycosylase 會偵測並移除特定的 damaged base

    • 例如 deamination 是一種將 cytosine (C) 變成 uracil (U) 的 reaction

      • 變成 uracil 的 cytosine 比起跟 guanine (G) 配對，更想跟 adenine (A) 配對

    • 為避免這種突變，Glycosylase 會把 deaminated cytosines 移除

      • DNA backbone 也會一起被移除

      • 最後由 DNA polymerase 和 ligase 把缺口補回

Nucleotide excision repair

  • Nucleotide excision repair 主要修復造成 DNA double helix 扭曲的傷害

    • 例如一些 bases 被大量 chemical 影響 (e.g., 菸中的致癌物)

    • 或是 UV radiation 造成 cytosine 或 thymine 會影響周圍的 Cs 或 Ts

      • 扭曲雙螺旋架構，造成複製發生錯誤

      • 最常見的是 thymine dimer (兩個 T 互相影響彼此)

  1. Helicase 將 DNA 打開成泡泡狀

  2. DNA cutting enzymes 將該泡泡切除

  3. DNA polymerase 製作新的 DNA 取代

  4. DNA ligase 將 backbone 缺口補平

Double-stranded break repair

外部環境可能會造成 DNA 損傷 (e.g., high-energy radiation)

  • 這種損傷通常為 double-stranded 被拆成兩半 (chromosome 裂成兩半)

    • 這種斷裂非常危險，可能造成 chromosomes, genes 永久遺失

    • 修復方法有兩種

      • non-homologous end joining

      • homologous recombination

non-homologous end joining

  • Chromosome 的斷裂兩端直接黏合

    • 可能造成黏接點突變

homologous recombination

  • Chromosome 的另外一半 (homologue, chromatid) 將會來支援

    • 另一半作為 template 來取代 chromosome 受損的區域

    • 修復的比 non-homologous end joining 還要完整

    • 較不會造成黏接點突變

DNA proofreading and repair in human disease

以上介紹的修復機制突變，和 heredity cancers 常有重大關聯

  • Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome)

    • 發生於製造 mismatch repair proteins 的 genes 突變

    • Mismatched bases 無法修復，讓突變累積起來，發展成 tumors

  • Xeroderma pigmentosum

    • 發生於 nucleotide excision repair 相關 genes 突變

    • Thymine dimers 和其他 UV damage 無法修復

    • 病人變得極度容易受到 UV light 影響

    • 暴露在太陽下幾分鐘就可以造成曬傷，半小時就有機會得到 skin cancer

Telomeres and telomerase

Chromosomes 的最末端會發現 TTAGGG 反覆出現幾百幾千次，這些是 telomeres

  • Telomeres 會保護 chromosome 的內部 gene

  • 並且在每次 DNA replication 後都會磨損一些

  • 磨損的 telomeres 會由 enzyme telomerase 來補充延長

The end-replication problem

這個問題通常發生在 eukaryotes 的 chromosome 上 (因為是 linear, rod-shaped)

  • Chromosome 的末端在 DNA replication 時會出現問題

    • 每一輪的 replication 當中，末端的 DNA 都無法完整的複製

    • 造成 chromosome 越來越短

這種情況分別發生在 leading strand 和 lagging strand

  • 在 lagging strand 的末端沒有辦法存在 Okazaki fragment

    • 因為 primer 會掉出 chromosome 末端之外

    • 就算有 primer，也無法繼續進行 DNA 的複製

      • 這是因為製作 DNA 需要 energy

      • Energy 來自 Okazaki fragment 的 hydroxyl group

      • 但末端沒有辦法向鄰居的 Okazaki fragment 取得 energy

在 leading strand 看起來很完整，但事實上也會被 enzymes 吃掉一些部分

  • 因為這些緣故，一些 eukaryotes 的 DNA 末端保留無複製進入下一輪 replication

    • 產生 single-stranded overhang (下圖)

    • 接著的 cell division 就會讓 chromosome 不斷變小

  • 在人類細胞中，最後一個 RNA primer

    • 在 lagging strand 會距離末端 70 到 100 個 nucleotides

    • 在 leading stran 會距離末端 30 個 nucleotides

    • 所以每一輪產生的 overhang 很長

Telomeres

為了避免 chromosome 越來越短，我們 eukaryotes 的 chromosome 末端有一個保護套叫做 telomeres

  • Telomeres 由上百上千個重複的 DNA sequence 組成

    • 在人類中是 5'-TTAGGG-3'

    • telomeres 需要避免被細胞的 DNA repair system 攻擊

      • 因為他看起來像一個 damaged DNA (single-stranded overhang)

Telomeres 會接續在未完成的 single-stranded overhang 上

  • telomere 會自己形成 protective loops

    • 跟 telomere 相關的 protein 也會起到保護作用，避免觸發 DNA repair

    • 於是不斷復生的 telomere loops 就可以代替在每個 replication 變短

      • 保護 chromosome 內部真正有用的 genes

Telomeres 也不是無限的，這也是為什麼細胞只能分裂有限次數，且跟細胞的衰老有關

Telomerase

一些細胞能夠利用 telomerase (enzyme) 來延長 telomeres

  • Telomerase 是一個 RNA-dependent 的 DNA polymerase

    • 意思是利用 RNA 作為 template 來製造 DNA

  • Telomerase 會結合包含 telomere 對應 sequence 的 RNA

    • 加入 nucleotides 到 telomere 的 overhanging strand

      • 可以想像是利用 RNA 作為 template 來補足 telomere DNA

    • 當 overhang 夠長，對應的 strand 就可以透過 DNA replication 產生

Telomerase 通常只出現在需要大量分裂的細胞中 (e.g., germ cells, adult stem cells)

有時也會出現在 cancer cells 中， 所以有些藥物可以抑制 cancer cells 中的 telomerase， 避免讓 telomere 不斷生長。

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