Central dogma

Central dogma and the genetic code

Intro to gene expression

DNA 是生物的 genetic material，但實際上 DNA 到底是怎麼樣來影響特徵的 ?

Genes specify functional products

• DNA 可以細分成好多個 functional units 叫做 genes

  • Genes 提供 instruction 來製作 functional product

    • 通常 functional product 是 protein

    • 例如 flower color gene 幫助 (提供指令) 製作控制花朵顏色的 protein

• 這些 protein 通常都是 polypeptides

  • Polypeptide 的意思是 chain of amino acids

  • 有的 protein 只有單個 polypeptide

  • 有的 protein 有多個 polypeptides

  • 幫助製作 polypeptides 的 gene 叫做 protein-coding genes

有的 gene 則幫助製作 functional RNA molecules (tRNA, rRNA, ...)

Gene expression

DNA 將透過 gene 的指令，用兩個步驟來建構 polypeptide:

1. Transcription

   • DNA sequence 會被"轉錄"成相似的 RNA sequence

   • 在 eukaryotes 中 RNA 會被處理成 messenger RNA (mRNA)

2. Translation

   • mRNA 被"翻譯"成對應的 amino acids "語言"

   • 這個 amino acids sequence 就是 polypeptide

整個從 DNA 變成 functional product 的過程叫做 gene expression

• 上面看到的 Gene expression 有兩種

  • expression of protein-coding gene

    • DNA → RNA (mRNA) → protein

    • 又稱為 central dogma

  • expression of non-protein-coding gene

    • DNA → RNA (functional RNA)

Transcription

• 被作為 template 的 strand 叫做 non-coding strand

• 沒事的另一個 strand 叫做 coding strand

RNA polymerase 將參考 non-coding strand 打造出對應的 primary transcript

• Primary transcript 會和 coding strand 擁有一模一樣的資訊

  • 但 base thymine (T) 會變成 base uracil (U)

Transcription 在 bacteria 和 eukaryotes 有很多不同處

• 在細菌中的 primary transcript

  • 會直接作為 mRNA (DNA 和 ribosomes 的媒介)

    • p.s. ribosomes 在 cytosol 負責製作 protein

  • Transcription 和 translation 都在 cytosol 中進行

• 在 eukaryotes 的 primary transcript

  • 需要一些步驟才能變成 mRNA

  • 在過程中 RNA 末端會有保護，且會被一點點消去 (splicing)

  • Transcription 在 nucleus 進行

  • mRNA 需要輸出到 cytosol 才能找到 ribosome 進行 translation

Translation

有了 mRNA 就可以翻譯成 polypeptide 了，這個步驟叫做 translation

• mRNA 中的 nucleotides 會以三個一組 (codon) 來讀取

  • 總共有 61 個 codons 來做出 amino acids

  • 其中一個是 start codon

    • 指定從哪裡開始 translation

    • 起點是 amino acid methionine

  • 其中三個是 stop codons

    • 提示 polypeptide 的終點

    • 這三個不算在 61+3 裡面，因為不是用來 coding protein

Codons 和 amino acids 的關係叫做 genetic code

Translation 在 ribosomes 裡面進行，釋出 polypeptides

• Ribosome 會和 mRNA 結合，找出 start codon

  • 然後開始往下讀取 mRNA (一次讀取一個 codon)

  • 產生對應 mRNA codons 的 amino acid sequence

但負責找出 codon 對應的 amino acid 的不是 ribosome 而是 transfer RNAs (tRNAs)

• tRNA 的一邊有 3 個 nucleotides

  • 用來找對應的 codon 是否有對應的 base-pair

• tRNA 另一邊則載著 amino acid

  • 這個就是對應 codon 的 amino acid

細胞中漂浮著很多 tRNAs，直到找到對應的 codon 並交付 amino acid 給他

• tRNA 在 ribosome 找到對應的 codon

  • amino acid 會被加入到 polypeptide chain 的末端

這些步驟會一直重複，直到 ribosome 讀到 stop codon 然後釋出 polypeptide

The genetic code

Codons

Codon 是三個 nucleotides 一組的產物，以下是 codons 的幾個特徵:

• 大部分的 codons 都對應一個 amino acid

• 3 個 "stop" codons 定義 protein 的終點

• 1 個 "start" codon (AUG) 定義 protein 的起點

  • 這個 codon 對應的是 amino acid methionine

mRNA 分成一個個 codons，由 5' 讀到 3'，產出的 amino acid 則從 N-terminus (methionine) 輸出到 C-terminus

• N-terminus 有 amino group exposed

• C-terminus 有 carboxyl group exposed

The genetic code table

Codons 和輸出的 amino acids，兩者之間的關係 (genetic code) 可以用完整的 genetic code table 表示

• 左邊是 codon 的第一個 base

• 上方是 codon 的第二個 base

• 右邊是 codon 的第三個 base

有的 amino acids 可以對應多種 codons，例如從表中可看出 leucine 對應了 6 種 codons 組合。

Genetic code table 有個重要的特點，就是幾乎可以對應所有物種合成 protein 的 RNA 組合

Reading frame

mRNA 到 protein 還有一個重要的概念是 reading frame

• 要怎麼在長長一段的 RNA sequence 找出正確的 codon 順序

  • 不同的看法就有不同的 reading frame

  • 例如下圖同個 mRNA 可以被看成三種完全不同的 polypeptide sequence

• 哪一個 frame 才是正確的 ?

  • 這要看 start codon 在哪裡

  • 因為 translation 永遠是從 start codon 開始，每三個為一組讀取

  • 所以上圖的 frame 3 才是正確的

另外 mutation 的發生 (insert, delete nucleotides) 會改變 reading frame

• Frameshift mutation

  • 上圖的 UA 就因為 mutation 而被刪除

  • 造成後方的 RNA 也被讀取錯誤

  • 最終產生錯誤的 protein

One gene, one enzyme

Mendel 雖然找到遺傳現象，但他沒發現他口中的遺傳因子 (gene)，跟其他重要的 functional molecules (e.g., protein) 有所關聯。

• 第一個找出 gene 和 protein 有所關係的是 Archibald Garrod (英國醫學家)

  • Garrod 觀察病人全家都有的 metabolic diseases 叫做 alkaptonuria

    • Alkaptonuria 會讓病人的尿變黑

    • 原因是他們無法分解 alkapton 這個 molecule

Garrod 認為這和 Mendel 提出的 recessive pattern of inheritance 有關

• Garrod 將這個現象定義成 "inborn error of metabolism"

  • 而且發現其他疾病也有相同現象

  • 因為發現 gene 和控制 metabolic reactions 相關的 enzymes 有關

  • 所以可以說是 "the father of chemical genetics"

Beadle and Tatum: Connecting genes to enzymes

Garrod 的想法沒得到重視，直到 1940s 兩位科學家 George Beadle 和 Edward Tatum 進行實驗

• Beadle 和 Tatum 使用 bread mold 作為實驗主角

  • bread mold 又稱 Neurospora crassa

  • Neurospora 有快速又方便的 life cycle

  • Neurospora 可以生存在 minimal 或 complete medium 當中

    • Minimal medium 只有 sugar, salts, biotin (vitamin)

    • Complete medium 則有豐富的養分讓細胞成長

Neurospora 細胞可以在簡單的 minimal medium 存活，是實驗成功的關鍵 !

Hypothesis

• 若 gene 真的和 biochemical enzymes 有關

  • 那麼 gene 一定會被外界因素改變 (mutation)

  • 從而將特定的 enzymes "消滅"掉

  • 讓細胞無法在 "minimal" medium 生存

也就是 Neurospora 可以在 complete medium 生存，但無法在 minimal medium 生存

• Beadle 和 Tatum 將 Neurospora spores 暴露在輻射中

  • 再來將它們的子代放到 complete medium 中

  • 當子代繁衍成一群 (colonies) 時，取出一些丟入 minimal medium 中

結果出爐 !

• 有的 colonies 能夠存活在 minimal medium

• 有的 colonies 無法存活在 minimal medium

  • 這些 colonies 就是 nutritional mutants

  • Nutritional mutants 的 gene 被破壞，無法產生存活必要的 molecule

    • 而他們可以存活在 complete medium

    • 因為 complete medium 提供了他們無法製造的養分

Pinpointing the broken pathway

Beadle 和 Tatum 進行了第二階段的實驗，為了是找出真正無法被生產的 protein

• 首先將 mutant 裝入 minimal medium (但還加入特別的東西)

  • 一種加入完整的 amino acids (20 種融合)

    • 如果該杯的 mutant 可以存活 (但 vitamin 那杯無法存活)

    • 代表 mutant 一定是無法生成 amino acids

  • 一種加入完整的 vitamins

    • 如果該杯的 mutant 可以存活 (但 amino acids 那杯無法存活)

    • 代表 mutant 一定是無法生成 vitamin

• 當確定是生成 amino acids 的 gene 被破壞後

  • 就可以進入第二輪的測試

    • 將 20 種 amino acids 的 medium 都測試一遍

  • 若 mutant 只存活在某一杯 amino acid medium

    • 就代表該杯就是 mutant 無法生成的 amino acid

這個做法讓 Beadle 和 Tatum 找到了 nutritional mutants 和 amino acid, vitamin 的關係

"One gene-one enzyme" today

Beadle 和 Tatum 的這個發現稱為 "one gene-one enzyme" 假設，但也在之後被進行了多次的更新

• Some genes encode proteins that are not enzymes.

  • Gene 不只用來編碼 enzymes (protein)

  • Gene 也用來編碼了其他 proteins

• Some genes encode a subunit of a protein, not a whole protein.

  • Gene 編碼出來的 polypeptide 只是單串 amino acids

  • 有很多 proteins 是由多個 genes 編碼的 polypeptides 組成

• Some genes don't encode polypeptides.

  • Gene 不只編碼 proteins

  • Gene 也編碼 functional RNA molecules

Transcription

Gene expression 的第一步，將 gene's DNA sequence 複製成 RNA copy (transcript)

• Bacteria 可以直接將 transcript 當作 mRNA

• Eukaryotes 則需要對 transcript 動些手腳才能變成 mRNA

負責 transcription 的是 RNA polymerase (enzyme)

• 將 double-stranded DNA 打開，並將其中一串 DNA 當作 template 來複製出 RNA

  • 方向是從 5' 到 3'

  • 被打開的 DNA 叫做 transcription bubble

人類等 eukaryotes 和細菌的 RNA polymerase 有所不同，和植物又不同

• 人類共有三種 RNA polymerase: I, II, III

  • 每種負責不同種類的 genes

• 植物又比人類多了兩種 RNA polymerase: IV, V

• 第一個被複寫成 RNA 的 DNA 地點稱為 initiation site

  • Initiation site 又稱為 +1 site

  • 在 +1 site 之前的都是負數，叫做 upstream

  • 在 +1 site 之後的都是正數，叫做 downstream

Transcription 有三大步驟: initiation, elongation, termination

Initiation

• RNA polymerase 到 DNA 上找到 promoter (gene 的開始)

  • 每個 gene 都有自己的 promoter

• RNA polymerase 和 promoter 結合後

  • 會將 DNA 打開，把其中一條當作 template 來複寫

In bacteria

• 細菌的 promoter 有兩種 DNA sequence

  • -10 elements

  • -35 elements

  • 取名來自它們在 +1 site 的前面 10 和 35 個 nucleotides 遠

• DNA 會在 -10 的地方被打開

  • 因為充滿 As 和 Ts 所以較容易被打開 (2 hydrogen bonds only)

In human

• 細菌的 RNA polymerase 會直接接觸 promoter

  • 但人類需要透過 basal transcription factors 先和 promoter 結合

  • 提供 RNA polymerase 一個立足點

• 大多的 eukaryotic promoters 會有一個序列叫做 TATA box

  • TATA box 的角色就像 -10 element 一樣

  • 讓一堆 basal transcription factors 找到他並結合

  • 最後吸引 RNA polymerase 來結合

Elongation

• RNA polymerase 開始讀取 template strand (一次讀取一個 base)

  • 讀取 DNA 的方向是 3' 到 5'

  • 製作出一條對應的 RNA copy chain (由 5' 到 3')

• RNA copy chain (transcript) 會和 coding strand 有一模一樣的資訊

  • 只是 uracil (U) 取代 thymine (T)

DNA 可以一次被很多 RNA polymerases 複寫

Termination

• DNA 中有一串序列叫做 terminator 會告訴 RNA 複寫完畢

  • 當 RNA 複寫到 terminators

  • 會讓 transcript 從 RNA polymerase 釋放出來

Termination 有兩大形式: Rho-dependent 和 Rho-independent

Rho-dependent termination

• 在 RNA 中會有一個 Rho factor (protein)

  • 會往上爬到 RNA polymerase 的地方

    • 將 RNA transcript 從 DNA template strand 拔出來

  • DNA 中會有一個 transcription stop point

    • 停止 RNA polymerase 幫助 Rho factor 趕上

Rho-independent termination

• DNA template 中有一個區域富含 Cs 和 Gs nucleotides

  • RNA 複寫這段時，會變成摺疊變成髮夾狀

  • RNA 髮夾會接續著 U nucleotides

    • 因為 U 是和 DNA 的 A 吸引 (2 hydrogen bond)

    • 所以容易被其他 enzyme 拉開

What happens to the RNA transcript?

• 在細菌中，完成複寫的 transcript 作為 mRNA

  • 會快速和 ribosomes 進行下一個步驟 "translation"

  • mRNA 和 ribosome 形成 polyribosome

而人類的 transcript 必須進行 RNA modification 變成 mRNA 先

Eukaryotic RNA modifications

RNA transcripts 在 bacteria 和 eukaryotes 有不同角色

• 在 bacteria 的 transcript 等於 mRNA

  • 可以開始 translation

• 在 eukaryotes 的 transcript 等於 pre-mRNA

  • 還需要程序才能變成 mRNA

5' cap and poly-A tail

程序一，在 pre-mRNA 的開頭 (cap) 和結尾 (tail) 加入保護機制，方便 mRNA 離開 nucleus

• 5' cap 會被加入到第一個 nucleotide

  • Cap 是一個 modified guanine (G) nucleotide

  • 保護 transcript 不被破壞

  • 幫助 ribosome 方便和 mRNA 結合

• 3' end 是多個 adenine (A) nucleotides 被加入到最後

  • RNA 在 transcription 有一個序列叫做 polyadenylation signal

  • Enzyme 會在這個序列將 RNA 切成兩半

  • 其他 enzyme 會再將 100 至 200 個 adenine (A) 加入到切點的後方，形成 poly-A tail

  • 讓 transcript 更穩固，幫助他更容易離開 nucleus

RNA splicing

程序二，RNA splicing 移除 pre-mRNA 不必要的地方，合併有用的地方

• 執行的是 spliceosome (protein-RNA complex)

  • 發現並移除 introns (沒用的 pre-mRNA 部分)

  • 接著發現並合併 exons (有用的 pre-mRNA 部分)

只有正確的 exons 組合才能真正合成 protein，多一點或少一點 introns 都會無法運作

Alternative splicing

Splicing 看起來很無意義，但他是為要 alternative splicing 而存在

• 一個相同的 gene 只要 splicing 切法不同

  • 就可以產生多種 mRNA 的結果

  • 製造出不一樣的 proteins

下圖時是一個 pre-mRNA 在保留各種 exons 時，產生不同的 protein 結果

Transcription happens for individual genes

• 每個細胞會調節每個 gene 被 transcript 的時機

  • 只有需要特定 products 的時候才會執行

  • 例如下圖對 4 種 gene 的要求不同，執行 transcription 的次數也不同

Translation

你知道 antibiotics 是怎麼殺死細菌的嗎 ? 其實就是靠著中斷細菌的 translation !

Translation molecules

要將 mRNA 正確 "read" 然後製作出 polypeptide 需要兩大 molecules: tRNAs 和 ribosomes

Transfer RNAs (tRNAs)

tRNAs 是 mRNAs codons 和最終 amino acids 的橋樑

• tRNAs 有兩側

  • 一側有一串 nucleotides 叫做 anticodon

    • Anticodon 會和對應的 mRNA codons 組合

  • 一側載著 codon 對應的 amino acids

tRNAs 的種類很多，每種都會讀取一或多個 codons 然後給他正確的 amino acids

The 3D structure of a tRNA

• 雖然上面的 tRNA 是長方形的，但實際上 tRNA 是 L 形的

  • 這是因為 nucleotides 之間形成 base pairs

  • 讓 tRNA 之間產生 double-standed 的 regions 還有 loops

其中的一邊是 anticodon，另一邊則是 amino acids

Loading a tRNA with an amino acid

• Amino acids 是透過一種 enzyme 來和正確的 tRNA 組合的

  • 這個 enzyme 叫做 aminoacyl-tRNA synthetases

  • 每一種 amino acid 都有不同的 synthetase enzyme

  • 組合中需要耗費一個 ATP

  • 有的 enzyme 具有 proofreading site 防止錯誤

Ribosomes

Ribosomes 是建造出 polypeptides 的地方

• Ribosome 由 protein 和 RNA (ribosomal RNA, rRNA) 組成

  • Ribosome 有兩個 subunits

  • 大的和小的，一起將 mRNA 像漢堡一樣夾住

• Ribosome 的架構中分別有三個區域 (A, P, E) 讓 tRNA 經過

• Ribosome 也會扮演 enzyme 的角色，催化 amino acids 串聯起來

Stages of translation

Translation 一樣可以分成三大部分: initiation, elongation, termination

Initiation

• Ribosome 集中包覆在 mRNA 周圍

  • 第一個 tRNA 來到現場

    • 這個 tRNA 帶著 methionine (對應 start codon: AUG)

整個 setup (ribosome + mRNA + Met-tRNA) 稱作 initiation complex，準備開始 translation

Initiation 的整個詳細步驟如下 (in eukaryotes):

1. 帶著 methionine 的 tRNA 依附在 small ribosomal subunit

2. 他們一起結合到 mRNA 的 5' GTP cap

3. 接著往 3' 方向走

4. 停在 start codon

在細菌中的 initiation 有些不同

• Small ribosomal subunit 會直接到達 Shine-Dalgarno sequences

  • 這是因為細菌的 genes 通常都是一整組 (operons) 一起 transcribe 的

  • 所以一個 mRNA 有不同的段落給不同的 genes

  • Shine-Dalgarno 方便讓 ribosome 快速找到位置

Elongation

在 initiation complex 形成之後，Amino acid chain 要開始變得 longer

• 每次 mRNA 一次讀取一個 codon

  • 對應的 tRNA 就會來結合

  • tRNA 運送的 amino acids 將和現有的 amino acid chain (polypeptide) 串起來 (chemical reaction)

  • mRNA 移動，讓下一個 codon 能夠被讀取

  • 整個過程 tRNA 會在 A, P, E sites 移動

    • A: Aminoacyl

    • P: Polypeptide forming

    • E: ready to Exit

1. 一開始 Met-tRNA 落在 P site

2. 新的 codon 在 A site 準備被讀取

   • 這時 tRNA 帶著新的 amino acid 來到 A site

   • 消耗 energy 和 codon 結合

3. P site 的 polypeptide 和 A site 的 amino acid 結合

   • 以 peptide bond 的形式結合

   • P site 的 polypeptide 轉移到 A site

     • P site 來的是 N-terminus

     • A site 的是 C-terminus

4. mRNA 被 ribosome 往後拉一個 codon

   • 在 P site 的 tRNA 來到 E site 準備離開

   • 一個循環結束

Elongation 最長可以到 33000 個 loops (形成肌肉中的 titin)

Termination

• 當 stop codon (UAG, UAA, UGA) 進入到 ribosome (A site) 的時候

  • polypeptide chain 將會被釋放

    • polypeptide 會折疊成 3D 形狀

    • 到細胞中下一個工作的地點

    • 或跟其他 polypeptide 組合

Stop codons 會被 release factors (protein) 認出

• Release factor 存在於 P site

  • 會擾亂形成 peptide bonds 的 enzymes

  • 透過加入水分子到 amino acid chain 的最後

  • 拆斷 chain 和 tRNA 以此釋放 protein

整個 translation 的工具 (ribosomal subunits) 會分開，然後可以重複使用