# Bioinformatics Overview

## Overview

* [Course site](https://www.coursera.org/learn/introduction-genomics/home/week/1)

### Why genomics ?

#### Central dogma 不是標準原則

* Central dogma 不是準則，有非常多的變異點
  * DNA 生成的 Protein 可以回來和 DNA 結合
  * 一些 modifiers (methylation) 可以改變 DNA
* 所以 information 不只順著影響，也會逆向影響

#### Sequencing

* Sequencing 是 genomics 的核心
  * 了解 gene 的所有影響
  * 因為 sequencing 的進步，可以測出單個 tumor 的 genome
  * 但目前無法完整分析

可以到 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 下載這些已經定序好的 gene data

### What is genomics ?

如果是指 strucutre:

* 人類身體大約有 3 billion 個 nucleotides (As, Cs, Gs, Ts) 組成 genome
  * 所有 genome 都被分成 23 個 chromosomes (22 + XX or XY)
  * Chromosome 又有 centromere 和 telomere

如果是指 function:

* Genome 能做什麼 ?
  * Encode 所有身體會用到的東西
  * Respiration metabolism
  * Building brain

如果是指 evolution:

* 一代一代傳下來的 genome 是幾乎沒有什麼變的
  * 但可以和其他生物比較

#### Difference between Biology-Genetics and Genomics

|            | Biology-Genetics                     | Genomics                            |
| ---------- | ------------------------------------ | ----------------------------------- |
| Scope      | targeted one or few genes            | all genes in a genome               |
| Technology | targeted, low-throughput experiments | global, high-throughput experiments |
| Hard part  | 設計良好實驗、不斷重複實驗                        | 大數據、大量計算、不確定性                       |

### What Is Genomic Data Science?

* Genomic Data Science = Bioinformatics
  * 包含 biology, statistics, computer science

Bioinformatics 在做什麼 ?

1. 收集任意 subject (e.g. human) 的細胞樣本
2. 對樣本執行 sequencing
3. 產生大量的 data
4. 每個 sequences 都是小片段，又稱為 reads
5. 將這些 reads 和 reference genome (e.g. average european male) 對齊
6. 開始分析差異
7. 儲存這些資料、分析結果到公開的 database (e.g. NCBI)
8. 對這些公開資料可以進一步分析

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1TtVG552SaqyuSe-GA%2F-M1TtX9WSWh5qvMYI87I%2Fgenomic_data_science.png?generation=1583213850621370\&alt=media)

上圖順時針共有 8 個步驟，對應於一些重要領域

* **Experimental design** (1, 2, 3)
  * 設計出你想研究的東西，產生 data
* **Alignment & Assembly** (3, 4)
  * 將 data 與 reference genome 對齊，找出差異，集中結果
* **Preprocessing & Normalization** (4, 5)
  * 避免巨量 data 產生 bias 所以要正規化
* **Statistics & Machine learning** (5, 7)
  * 用一些技巧來得出結論
* **Software development** (8)
  * 利用現成軟體來加速進行
* **Population genomics** (5, 7, 8, 1)
  * 不一定只有找出 cancer 原因，也能找出同一群人的特徵 (e.g. 容易得到疾病)
* **Integrative genomics** (6, 7, 8, 1)
  * 把所有結果整合

### The human genome project

* 1989 開始由 NIH + DOE (US) 主導
  * 一開始目標，在 2005 前 sequence 3 billion basepairs ($1 per base)
* Early 1990s
  * busy creating maps
  * analyze small or large pieces of DNA
* 1995
  * TIGR (Craig Venter)
  * 在 haemophilus influenzae (嗜血桿菌) 序列出完整基因
  * 1.8 million bases
  * 1742 genes
* 1998
  * new sequencing machine
  * Celera Genomics company
* June 2000
  * completion of the human genome
  * "Draft"

#### How many genes do we have ?

在 3 billion 的 bases 中，有多少 encoded genes ?

* 1964
  * 6.7 million genes?
* Feb 2001 (Nature 409)
  * 30000 - 40000 genes
* Feb 2001 (Science 291)
  * 26588 genes + 12000 likely genes
* Today
  * 99.9% genome have been sequenced
  * 22000 - 23000 genes

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PLN4KlPeOJNCYY%2Fgene_count.png?generation=1583594094769680\&alt=media)

#### Project result

* sequence 3 billion basepairs - **succeed!**
* $1 per base - **$1 per 700 bases!**
  * 700 bases are one **read**
* by 2005 - **done in 2001!**
* Cost today - **$1 per 3 million bases!**
  * 4000-fold cheaper&#x20;

## Measurement Technology

### Polymerase Chain Reaction (PCR)

* PCR 是製作 DNA copy 的一個重大技術
* 用 **DNA polymerase** 幫助複製
* 因為每做一回合，就拿到雙倍的 DNA copy，是一個 **chain reaction**

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PROlDtHlejbcnE%2Fpcr_machine.png?generation=1583594097433981\&alt=media)

* 製作材料
  * DNA
  * Primers (告訴 DNA polymerase 哪裡開始複製)
  * DNA polymerase
  * A's, C's, G's, T's
* Recipe
  1. 加熱到 94 度 C
  2. 退火 (冷卻) 到 54 度 C
  3. 回溫到 72 度 C
  4. 回到第一步 (約 30 次 cycle)

首先 2 個 primers 附到 DNA 的兩側開頭 (綠色和藍色)

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PTaGt4LRmzkecU%2Fpcr_1.png?generation=1583594094663939\&alt=media)

慢慢加熱，使得 DNA double-strand 和 primers 都慢慢分開

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PVhLOAK_vYgW4u%2Fpcr_2.png?generation=1583594104216260\&alt=media)

再來慢慢冷卻，不讓 DNA 回復，但讓 primers 回復

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PXB3b71V7uBMjk%2Fpcr_3.png?generation=1583594100212805\&alt=media)

讓 DNA polymerase 還有一堆 As, Cs, Gs, Ts 加入，開始複製 DNA (溫度些微加熱)

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PZTKTTq2weUVm0%2Fpcr_4.png?generation=1583594094870345\&alt=media)

我們得到了一倍的 DNA copy，下一輪也是如此

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PaBHtgW1dg4pCm%2Fpcr_5.png?generation=1583594113290471\&alt=media)

通常持續 30 次迴圈，所以共可產生 2^30 個 DNA copy (約十億個 DNA copy)

### Next Generation Sequencing (NGS)

* 現在所用的 data 多為 2007 之後 NGS 技術所產生的 sequencing data

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PeQNfsmbmZZt_F%2Fsequencing_history.png?generation=1583594112434895\&alt=media)

Recall 一下 DNA 是怎麼複製的:

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PgJGRJjztJzkeh%2Fdna_copying.png?generation=1583594095455288\&alt=media)

NGS 將大量 template DNA 放在 slide 上面，下圖只用兩個舉例

對大量 template DNA 進行 PCR，產生 copy

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PjQEycejNlZrof%2Fngs_1.png?generation=1583594111412101\&alt=media)

利用這個原理，對將被用來複製的 nucleotides 塗上顏色

在他們被複製時按下快門，就可以看到顏色得到對應的原 bases

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PmCBhEIzPTPSRQ%2Fngs_2.png?generation=1583594095387488\&alt=media)

重複在每個 base 被加入時拍照，就可以得到原本的 sequence

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PpHnHRgcAxEYBZ%2Fngs_3.png?generation=1583594103300716\&alt=media)

但在越後面的 cycles 會出現越多的錯誤

例如某一些 template 的速度較其他 template 快，某些較慢。所以無法同時一次讀取上千個 base

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1Pr8TW8v75GqoQL%2Fngs_5.png?generation=1583594109449429\&alt=media)

最終結果如下，有的跟在 ACGT 的是 quality value (正確率)

Quality value 由些 base calling 軟體來評估

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PtNEayR0IKHJH0%2Fngs_6.png?generation=1583594101499925\&alt=media)

### Application of Sequencing

由於 NGS 可以非常快速定序，且又非常便宜，所以產生了一些相關的應用

* Basic idea
  * 轉換一些東西變成 DNA (例如 RNA)
  * 對 DNA 進行 NGS

#### Exome sequencing

* 人類大約有 1.5% genes (30 to 60 million bases) 是 exons
  * Exons (Exome) 是 genome 中負責 protein-coding 的 genes

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PvATGhA7Maiv2W%2Fexome_1.png?generation=1583594110353675\&alt=media)

* 為了從一堆 DNA fragment 中取出 exons 的部分
  * 有一個 magnetic bead 的工具
  * Bead 上有 DNA 中的 exon 部分
* 我們將要測試的 DNA 加熱變成 single-strand
  * Exons 會和 bead 上的對應 DNA 結合 (hybridize)
  * 接著就可以把這些 exons 取出進行定序

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PxQeZVz8nYqK1O%2Fexome_2.png?generation=1583594105444165\&alt=media)

這樣就可以只定序到 exome (約 50 - 60 million bases)

#### RNA-Seq (RNA sequencing)

為了找出哪些 DNA 真的產生蛋白質，可以從哪些 DNA 變成 RNA 開始找起

DNA 在 transcribe 成 RNA 會得到很長的 poly-A tail

所以我們用很長的 Ts 和 As 結合，然後用一些方法把 RNA 從 Ts 拿起來

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1PzRU6zHBCQ1rFN%2Frnaseq_1.png?generation=1583594096333327\&alt=media)

要定序 RNA 要先轉回 DNA (需要一些病毒所擁有的 reverse transcriptase 幫助)

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1Q08hi_YoscaOMv%2Frnaseq_2.png?generation=1583594108613429\&alt=media)

有了從 RNA 轉回的 DNA，就可以進行定序

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1Q2Q4hjZFutqSYc%2Frnaseq_3.png?generation=1583594095118363\&alt=media)

再來就可以解決更難的問題，例如找出被該 RNA 啟動的功能

#### ChIP-Seq

ChIP-Seq 目標是找出 DNA **哪個位置**會和蛋白質 (e.g. transcription factors) 結合 (影響 gene expression)

首先找出感興趣的細胞，利用 cross-link 將蛋白質結合 DNA

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1Q4WbwK4ZnFBrxx%2Fchipseq_1.png?generation=1583594091315671\&alt=media)

接著將 DNA 拆成一片一片，有的沒有蛋白質結合，有的有結合

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1Q6NOA2aAqewEpE%2Fchipseq_2.png?generation=1583594107689654\&alt=media)

然後將特製的 antibodies 放入這群 DNA 碎片中，他會將有蛋白質結合的 DNA 拉出來

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1Q8TX-48rgLZOW6%2Fchipseq_3.png?generation=1583594099340889\&alt=media)

然後就可以把蛋白質移除，對 DNA 定序 !

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1QA_6xdis3Ec_ui%2Fchipseq_4.png?generation=1583594114338621\&alt=media)

#### Bisulfate sequencing (methylseek)

目標是找出 genome 何處被 methylated (甲基化)

* Methylation 是很重要的 epigenetic modification
  * 也影響了哪些蛋白質會被產生
  * Methylation marks (methyl groups) 可因細胞分裂來傳遞
  * Methyl groups 只會附在 Cytosine (C) 上面

首先將 DNA 分成兩個相等的樣本

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1QCXaWZLYjuzfFX%2Fbisulfateseq_1.png?generation=1583594098252035\&alt=media)

對一邊進行 bisulfite conversion，會將沒有甲基化的 C 轉換成 U

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1QEKG6VQmnI_XSp%2Fbisulfateseq_2.png?generation=1583594102651607\&alt=media)

然後對兩邊都進行定序，定序同時需要 aligner 幫助對齊比對 (將 U 和原本 C 的位置對齊)

![](https://2991100231-files.gitbook.io/~/files/v0/b/gitbook-legacy-files/o/assets%2F-LhyC30yNfTP1YdCIj83%2F-M1pYw-ATyPxI4nA7RtJ%2F-M1pZ1QGbk4YlYfjL-pX%2Fbisulfateseq_3.png?generation=1583594106390818\&alt=media)
